泰迪狗狗狂犬病症状是什么症状？
狂犬病的典型临床表现为急性恐怖死亡性神经症状，一般潜伏期为1～3个月不等，发病后病死率几乎为100%[2]。 狂犬病在动物中的发病过程与人类相似[3-4]，但具体病程及表现仍有待进一步研究。
目前有关狂犬病的诊断主要依赖临床症状、流行病学资料和实验室检查等，而临床上常用的诊断手段主要是病毒分离鉴定以及血清学和核酸检测。由于狂犬病毒对理化因素抵抗力不强，通常于脑组织内存活6个月至数年，因而目前狂犬病毒的分离鉴定仍是最常用的诊断方法之一[5]；然而该检测方法耗时耗力且敏感性不高。
为了寻求一种快速、敏感、特异的诊断方法来取代现有的分离鉴定手段，近年来一些学者尝试利用各种分子生物学技术来进行检测，包括免疫酶染（immunoenzyme staining， IES）、反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction， RT‐PCR）、基因芯片等技术[]。这些新技术的应用大大地提高了对狂犬病的检出率。
尽管RT‐PCR是较为敏感的狂犬病毒检测技术[7-8]，但其操作复杂且难以标准化，因此无法广泛应用于临床。最近，王春晓等[9]建立了基于荧光染料Cy5标记的探针的荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization， FISH）诊断法用于狂犬病毒感染的诊断。
本实验通过FISH方法来检测狂犬病患者尸体的脑组织中是否有狂犬病毒的核酸存在，以期达到早期快速诊断的目的，从而及时采取相应的治疗措施以提高患者生存率。
材料与方法 一、标本来源 本试验中所用组织样品分别来源于北京某医院收治的2例疑似狂犬病患者尸体（男，年龄分别为38岁和47岁）。所有病例均为被病犬咬伤所致，经临床诊断后由北京市东城区公安局法医中心签署死亡证明书并获取尸体。
二、试剂与仪器 噬菌体展示肽片段引物合成采用上海生工生物工程技术服务有限公司合成；MethoChip RNA Kit试剂盒购自德国MBIFermentas公司；DNaseⅠ、Duplex PCR Master Mix、Cy5荧光素、Cy3荧光素均购自宝生物工程（大连）有限公司；荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司;FISH检测分析软件系统为南京凯基生物技术研究所开发的FISH图像分析与分析软件系统，图象处理流程见参考文献12];实时定量PCR仪Roche Light Cycler 480 II型。
三、RNA提取及纯化 取适量标本，加入Trizol溶解剂均匀研磨，按说明书步骤抽提组织总RNA，并用DNaseI去除总RNA模板中含有的基因组DNA残留；取少量上述提取液进行琼脂糖凝胶电泳进行检测。
四、逆转录合成交叉互补DNA 按说明书所述方法，设计噬菌体展示肽序列上游引物和下游引物，以纯化的总RNA为模板合成cDNA第一链。
五、探针标记及探针筛选 将第1轮得到的阳性样本期盼值（peak value， PV）最高的寡核苷酸探针作为第2轮的探针模板，再制备含有10个寡核苷酸的随机探针集。
六、探针集的优化 将第2轮获得的PV最大的2支探针组合成15mer探针，同时以10nt探针做对照。将这3种探针分别与靶序列进行FISH杂交，观察其PV大小并进行比较，最终确定最佳的15mer探针。
七、荧光原位杂交及结果判定 以Cy3/Cy5两种荧光基团分别标记的随机引物探针集作为阳性对照，以未转录合成的寡脱氧核苷酸为空白对照，对脑组织切片进行处理，然后进行杂交、洗脱、显色，观察并记录杂交信号。按照以下标准判断信号强度及其阳性率是否高于阴性对照。
八、实时定量PCRRNA的提取与扩增参照TRIZOL®试剂说明书从组织中提取RNA，使用MethoChip RNA试剂盒进行反转录。根据试剂盒提供的引物信息自行设计并合成包含2对引物的SYBR Prime Script Mixture，其序列为：
正向：5′GCAGCTTTCGTACTGGAGAACTC－3′；反向：5′−ATTCCTGTTTAGATCATGCACA–3′。反应体系含2×PrimeScript Buffer 10 μl， PrimeScript RT Enzymes Mix 0.5 μl， Oligo dT Primer (50 ×) 1μl， RNase Free dH2O 8.5 μl， Total RNA 1 μg。反应条件如下： 30℃ 10 min， 42℃ 50 min， 85℃ 5 s。
九、数据处理 对实时定量检测结果进行统计学分析，结果以（±s）表示，组间差异显著程度运用SPSS software 17.0 统计软件进行分析，P<0.05被认为有统计学意义。
结 果 一、荧光原位杂交结果 经杂交处理后FISH结果显示，其中一例样本出现了两条清晰的杂交带，一条位于细胞质中，一条位于细胞核内；另一例样本则只有位于细胞核内的单